研究背景：
在神经内分泌(NE)小细胞肺癌细胞与非NE化疗耐药细胞共存的瘤内异质性可能会加剧复发。最近的证据表明，小细胞肺癌的瘤内异质性可能源于MYC介导的Notch信号的诱导和非NE细胞状态的促进。研究表明，免疫检查点阻断和放射治疗使癌细胞对最近描述的一种被称为铁死亡的调节坏死类型敏感。
初治的小细胞肺癌(SCLC)中，TP53和RB1的丢失表明在治疗前有选择性地施加压力来灭活细胞死亡途径。然而，这些途径哪一个在初治的小细胞肺癌的治疗中有用仍然是未知的。
结果解读
初治的小细胞肺癌表现为调节细胞死亡通路失活
研究者首先分析了主要初治的小细胞肺癌患者中的RNA表达水平，并与其正常肺组织样本进行了比较。发现小细胞肺癌原发患者组织中涉及外源性凋亡途径的基因(图1A)明显下调，如肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL，基因名称TNFSF10)、caspase8(CASP8)和CD95L(FASLG)12(图1D)，且外源性凋亡途径在治疗前是无效的（图1E）。数据表明，在诊断和治疗之前，强大的选择压力可能已经使小细胞肺癌中外源性凋亡和坏死的途径都失去了能力。重要的是，铁死亡与驱动细胞凋亡或坏死性死亡的分子机制无关(图1C)。接下来评估了小细胞肺癌患者样本中铁死亡调节剂的表达。SLC7A11在小细胞肺癌中表达强烈，在正常肺组织中只有极低水平的表达(图1J，k)。用XCT抑制剂erastin处理小细胞肺癌细胞，而对非小细胞肺癌细胞则用少剂量，导致剂量依赖性的细胞*性(图1L)。
综上，小细胞肺癌在治疗前已经进化到具有多个水平的细胞死亡抵抗，即外源性凋亡，坏死和铁死亡。
图1
小细胞肺癌易受铁死亡的诱导
Gpx4小分子抑制剂RSL3可以阻断细胞铁死亡，无论是否有Ferrostatin-1(Fer-1)的存在。为了验证SCLC是否容易受到铁死亡的影响，用RSL3处理小鼠SCLC细胞。RSL3有效取消了贴壁细胞的克隆生长（图2A）。此外，由RSL3，ML引起的额外细胞死亡，可通过与Fer-1共孵育来挽救(图2B)。结果表明，RSL3、ML和erastin诱导了小细胞肺癌细胞铁死亡（图2A、D）。为了确定Gpx4是否足以保护SCLC免受铁死亡的影响，研究者建立了CRISPR/Cas9介导的对照或Gpx4基因敲除(KO)的SCLC系。发现无Fer-1时，带有Gpx4靶向gRNA的细胞选择性地死亡(图2F)，Gpx4KOSCLC细胞出现铁死亡。而Fer-1存在时，Gpx4KO在蛋白质水平上被证实了(图2G)。综上，以上结果支持药物诱导铁死亡时对游离铁和脂质自由基的要求，并表明Gpx4为足以防止小细胞肺癌脂质过氧化和铁死亡的主要物质。
图2
非NE型小细胞肺癌对铁死亡极为敏感
为了了解铁死亡敏感性是否是所有小细胞肺癌分子亚型的共同特征，研究者在一组更大的人(n=8)和小鼠(n=6)代表所描述的SCLC分子亚型的SCLC系中测试了铁死亡的敏感性。结果显示人类和小鼠铁无反死亡应者特异性地丧失积累脂质ROS的能力。研究者分析了人SCLC细胞的mRNA表达模式，比较了分成两个不同的组的铁死亡反应者和无反应者(图3D)。发现当无反应者的ASCL1的表达增加时，反应者表达了高水平的REST1，基因富集分析的结果也与此一致（图3F）。小鼠小细胞肺癌细胞可以自发地从非NE(REST1+，ASCL1?)转变为NE-ASCL1+(NE)状态，分别以贴壁生长和悬浮生长为特征。在RPM小鼠模型中，RPM细胞对铁死亡的敏感性明显高于RP细胞，并且确实显示非NE标记REST1和VIM的表达略有增加(图3J，K)。
图3
非NE/NE小细胞肺癌亚型以脂质代谢重构为特征
首先研究者对.5个贴壁细胞和悬浮细胞进行了测序RNA来比较常见的铁死亡调节剂，发现PE的过氧化靶标脂质的可用性增加了，促进了非NE小细胞肺癌细胞的铁死亡。接着对贴壁细胞和悬浮细胞中的总磷脂进行质谱分析，发现大多数二酰甘油(DAG)多不饱和脂肪酸(PUFA)水平在悬浮细胞中不变或升高(图4b，c)，而粘合剂显示了几种醚联多不饱和脂肪酸种类的选择性上调(图4D，E)。表明了在非NE/NE转分化过程中脂质代谢重塑，分别与铁死亡敏感性和耐药性有关。且当内质网驻留的乙醚脂质合成酶1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶2(AGPAT2)或AGPAT3沉默后，非NE小细胞肺癌细胞对铁死亡的敏感性降低(图4G，H)。综上，小细胞肺癌的非NE/NE可塑性涉及乙醚类脂合成的下调，导致脂质体不容易受到脂质过氧化的影响。
图4
NE小细胞肺癌细胞对TRX抗氧化途径的选择性上瘾
研究者测定了NE小细胞肺癌细胞内GSH及其氧化型GSSG的浓度。结果显示，在表达NE、SCLC的ASCL1细胞中，GSH合成受到特异性抑制。硫氧还蛋白还原酶1(TrxR1，基因名TXNRD1)是硫氧还蛋白(Trx)抗氧化途径的一部分，减少的TRX可以通过TXNIP限制TRX的抗氧化性防御而被隔离(图5A)。TXNIP在人和小鼠NE细胞中的表达持续增加，表明NE小细胞肺癌细胞也经历了有限的Trx介导的抗氧化防御(图5B)。GCLC抑制剂丁硫氨酸亚砜(BSO)在非NE贴壁细胞中诱导了铁死亡，而TrxR1和TrxR2抑制剂Auranofin在NE悬浮细胞中诱导的不是铁死亡(图5E，F)。利用人工分离贴片培养法证明了在NE转分化过程中已经含有ASCL1高表达的细胞亚群。最后又评估了BSO/Auranofin联合应用对非NE和NE小细胞肺癌细胞的协同杀伤作用程度。结果显示BSO/Auranofin联合治疗在两种亚型中都诱导了非常有效的细胞死亡。
图5
铁死亡诱导和TRX途径抑制相结合，在体内显示了对小细胞肺癌NE亚型的广泛治疗效果，并可作为人小细胞肺癌的预后标志物
研究者将含有50%ASCL1?细胞和50%ASCL1+细胞与小鼠贴壁细胞和悬浮细胞50：50混合后分别移植到小鼠体内。根据肿瘤体积将小鼠随机分为四组，分别接受赋形剂、BSO、Auranofin或联合治疗(COMBO)连续两周。发现只有联合用药取得了显著的抗肿瘤反应(图6A)，且诱导的是铁死亡。BSO治疗的肿瘤只表现出ASCL1+细胞增多的趋势，而Auranofin治疗的肿瘤ASCL1趋势显著降低(图6C)。接着从一名未接受治疗的小细胞肺癌患者和一名化疗后复发的小细胞肺癌患者身上获得了CDX(图6G，H)。这两种CDX被证实表达NE标记，对Auranofin敏感，但对BSO引起的铁死亡不敏感，而正常外周血单核细胞(PBMC)对Auranofin敏感，提示*性水平较低(图6I)。当分析Gpx4和TXNRD1联合低表达模拟联合治疗的SCLC患者时，与高/高组的16个月中位生存期相比，他们的中位生存期显著提高了43.5个月(图6L)。综上，Gpx4和TXNRD1的低表达可作为小细胞肺癌总体生存的独立、特异的预后标志物。
异质SCLC培养通过单一途径靶向选择性地消耗非NE或NE亚群，并显示出治疗下的可塑性(图7)。
图6
图7
总结：本研究揭示了细胞死亡途径挖掘是识别小细胞肺癌合理联合治疗的一种手段。而联合铁死亡诱导/TRX通路抑制可能特异性地解决小细胞肺癌中NE/非NE的异质性和可塑性问题。
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